MS培养基的配制与灭菌

MS培养基的配制与灭菌

植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基。MS培养基的配制包括以下步骤。培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。大量元素(母液Ⅰ) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ)KI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ)FeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ)ⅣA肌醇 20 000ⅣB烟酸 100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸 400以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至55，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(01 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为01 mg/mL的母液。配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(54～70)测培养基的pH，一直到培养基的pH为58为止(培养基的pH必须严格控制在58)。培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培养基，可分装25～30瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm×9 cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口)，用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 ℃下，灭菌20 min。灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。